Dithiothreitol (DTT) är ett vanligt använt reduktionsmedel, även känt som den nya gröna tillsatsen.Det är en liten molekylär organisk förening med två merkaptangrupper (-SH).På grund av dess reducerande egenskaper och stabilitet används DTT i stor utsträckning i biokemi och molekylärbiologiska experiment.
Den huvudsakliga rollen för DTT är att minska disulfidbindningar i proteiner och andra biomolekyler.Disulfidbindningen är en viktig del av proteinveckning och stabilitet, men under vissa experimentella förhållanden, såsom reducerbar SDS-PAGE-analys, proteinrekombination och veckning, är det nödvändigt att reducera disulfidbindningen till två tiolgrupper för att reda ut den rumsliga strukturen av proteinet.DTT kan reagera med disulfidbindningar för att reducera dem till merkaptangrupper, vilket öppnar upp proteinets rumsliga struktur och gör det enkelt att analysera och manipulera.
DTT kan också användas för att skydda enzymaktivitet och stabilitet.I vissa enzymkatalyserade reaktioner kan enzymets aktivitet reduceras av oxidanten.DTT kan reagera med oxidanter för att reducera dem till ofarliga ämnen och därigenom skydda enzymets aktivitet och stabilitet.
Jämfört med traditionella reduktionsmedel som β-merkaptoetanol (β-ME) anses DTT vara ett säkrare och mer stabilt reduktionsmedel.Det är inte bara stabilt i vattenlösning, utan bibehåller också sina reducerande egenskaper under höga temperaturer och syra-basförhållanden.
Användningen av DTT är relativt enkel.I allmänhet löses DTT i en lämplig buffert och läggs sedan till det experimentella systemet.Den optimala koncentrationen av DTT måste bestämmas i enlighet med det specifika experimentet och används vanligtvis i intervallet 0,1-1 mM.Lägre koncentrationer kan minska negativa effekter på celltillväxt och kan minska cytotoxicitet på grund av överuttryck av målproteiner.Högre koncentrationer kan orsaka överdriven cellmetabolisk börda, vilket påverkar celltillväxt och expressionseffektivitet.
Sättet att bestämma den optimala koncentrationen kan vara att utvärdera uttrycksnivån för målproteinet genom att utföra IPTG-induktionstester vid olika koncentrationer.Småskaliga odlingstester kan utföras med användning av en rad IPTG-koncentrationer (t.ex. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, etc.) och expressionseffekten vid olika koncentrationer kan utvärderas genom att detektera expressionsnivån för målproteinet (t.ex. Western blot eller fluorescensdetektion).Enligt de experimentella resultaten valdes koncentrationen med bäst uttryckseffekt som optimal koncentration.
Dessutom kan du också hänvisa till relevant litteratur eller erfarenheter från andra laboratorier för att förstå det vanliga IPTG-koncentrationsintervallet under liknande experimentella förhållanden, och sedan optimera och justera efter de experimentella behoven.
Det är viktigt att notera att den optimala koncentrationen kan variera beroende på olika uttryckssystem, målproteiner och experimentella förhållanden, så det är bäst att optimera från fall till fall.
Sammanfattningsvis är DTT ett vanligt använt reduktionsmedel som kan användas för att reducera disulfidbindningar i proteiner och andra biomolekyler och för att skydda enzymaktivitet och stabilitet.Det har använts i stor utsträckning i biokemi och molekylärbiologiska experiment.
Posttid: 2023-09-28