IPTG (isopropyl-β-D-tiogalaktosid) är en analog till β-galaktosidassubstratet, vilket är mycket inducerbart. Under induktion av IPTG kan induceraren bilda ett komplex med repressorproteinet, så att repressorproteinets konformation förändras, så att det inte kan kombineras med målgenen, och målgenen uttrycks effektivt. Så hur ska koncentrationen av IPTG bestämmas under experimentet? Ju större desto bättre?
Låt oss först förstå principen för IPTG-induktion: E. colis laktosoperon (element) innehåller tre strukturella gener, Z, Y och A, som kodar för β-galaktosidas, permeas respektive acetyltransferas. lacZ hydrolyserar laktos till glukos och galaktos, eller till allolaktos; lacY tillåter laktos i omgivningen att passera genom cellmembranet och komma in i cellen; lacA överför acetylgruppen från acetyl-CoA till β-galaktosid, vilket innebär att den toxiska effekten avlägsnas. Dessutom finns en operationssekvens O, en startsekvens P och en regulatorisk gen I. I-genkoden är ett repressorprotein som kan binda till position O i operatorsekvensen, så att operonen (meta) undertrycks och stängs av. Det finns också ett bindningsställe för det kataboliska genaktivatorproteinet - CAP-bindningsstället uppströms om den initierande sekvensen P. P-sekvensen, O-sekvensen och CAP-bindningsstället utgör tillsammans den regulatoriska regionen för lac-operonen. De kodande generna för de tre enzymerna regleras av samma reglerande region för att uppnå ett koordinerat uttryck av genprodukter.
I frånvaro av laktos är lac-operonet (meta) i ett tillstånd av repression. Vid denna tidpunkt binder lac-repressorn som uttrycks av I-sekvensen under kontroll av PI-promotorsekvensen till O-sekvensen, vilket förhindrar RNA-polymeras från att binda till P-sekvensen och hämmar transkriptionsinitiering; när laktos är närvarande kan lac-operonet (meta) induceras. I detta operon (meta)-system är den verkliga induceraren inte laktosen själv. Laktos kommer in i cellen och katalyseras av β-galaktosidas för att omvandlas till allolaktos. Den senare, som en inducermolekyl, binder till repressorproteinet och förändrar proteinkonformationen, vilket leder till dissociation av repressorproteinet från O-sekvensen och transkription. Isopropyltiogalaktosid (IPTG) har samma effekt som allolaktos. Det är en mycket kraftfull inducerare som inte metaboliseras av bakterier och är mycket stabil, så den används ofta i laboratorier.
Hur bestämmer man den optimala koncentrationen av IPTG? Ta E. coli som exempel.
Den genetiskt modifierade E. coli BL21-stammen innehållande den positiva rekombinanta pGEX (CGRP/msCT) inokulerades i LB-vätskemedium innehållande 50 μg·mL-1 Amp och odlades över natten vid 37 °C. Ovanstående kultur inokulerades i 10 flaskor med 50 ml färskt LB-vätskemedium innehållande 50 μg·mL-1 Amp i förhållandet 1:100 för expansionskultur, och när OD600-värdet var 0,6~0,8 tillsattes IPTG till den slutliga koncentrationen. Den är 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1. Efter induktion vid samma temperatur och samma tidpunkt togs 1 ml av bakterielösningen från den, och bakteriecellerna uppsamlades genom centrifugering och utsattes för SDS-PAGE för att analysera inverkan av olika IPTG-koncentrationer på proteinuttryck, och sedan välja IPTG-koncentrationen med det största proteinuttrycket.
Efter experiment har det visat sig att koncentrationen av IPTG inte är så hög som möjligt. Detta beror på att IPTG har en viss toxicitet för bakterier. Att överskrida koncentrationen dödar också cellen; och generellt sett hoppas vi att ju mer lösligt protein som uttrycks i cellen, desto bättre, men i många fall när koncentrationen av IPTG är för hög kommer en stor mängd inneslutning att bildas. Kroppen, men mängden lösligt protein minskar. Därför är den lämpligaste IPTG-koncentrationen ofta inte ju större desto bättre, utan ju lägre koncentrationen är.
Syftet med induktion och odling av genetiskt modifierade stammar är att öka utbytet av målproteinet och minska kostnaderna. Uttrycket av målgenen påverkas inte bara av stammens egna faktorer och expressionsplasmiden, utan även av andra externa förhållanden, såsom inducerarens koncentration, induktionstemperaturen och induktionstiden. Därför är det i allmänhet bäst att studera induktionstiden, temperaturen och IPTG-koncentrationen innan ett okänt protein uttrycks och renas för att välja lämpliga förhållanden och få bästa möjliga experimentella resultat.
Publiceringstid: 31 december 2021